陈间美 李晋祯 何晓彤 王玲
摘要：分别以热带假丝酵母、产朊假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉为出发菌株对菠萝皮渣生产优质高菌体蛋白饲料进行发酵优良菌种的筛选试验，以发酵产物中的粗蛋白含量为考核指标，筛选出1～2株优势菌株;将筛选出的优势菌株按一定比例混合使用，对菠萝皮渣进行固态发酵生产菌体蛋白饲料，研究了接种量、料液比、温度、发酵时间等对发酵产物理化品质及感官指标的影响。结果表明，绿色木霉和产朊假丝酵母为试验的较优菌种;将绿色木霉与产朊假丝酵母1∶1体积比混合种子液使用对菠萝皮渣进行固态发酵：混合菌种总接种量10%，料液比1∶3，发酵温度30 ℃，发酵时间96 h为最优发酵条件。此工艺条件下，菠萝皮渣发酵所得的蛋白饲料产物的粗蛋白质含量最高、氣味也比较好。
关键词：菠萝皮渣;菌体蛋白饲料;菌种的筛选;发酵条件优化
中图分类号：S816.3 文献标志码：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2020.02.014
Fermentation Strains Selection and Fermentation Paraments Optimization of
Protein Feed from Pineapple Pomace
CHEN Jianmei，LI Jinzhen，HE Xiaotong，*WANG Ling
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）
Abstract：To improve the content of crude ptotein in pineapple pomace，Candida tropicalis，Candida utilis，Trichoderma viride and Aspergillus niger were used as the starting strains to ferment pineapple pomace in this reserch from the above four strains. Using the crude protein content in the fermentation product as an indicator，one or two dominant strains were selected. The inoculum size，water-material ratio，fermentation temperature and fermentation time were important fermentation conditions in the fermentation process. The selected strains were mixed in a certain proportion to ferment pineapple pomace and carried out the optmiazation of the important fermentation conditions according to single factor experiment. The optimal fermentation conditions were obtained as followed：Trichoderma viride and Candida utilis were the best strains for this experiment;Trichoderma viride and Candida utilis were used as a mixed bacterial solution for the pineapple pomace fermentation in 1∶1 volume ratio：10%（V/W）inoculum size of the mixed bacterial solution，material water ratio 1∶3，fermentation temperature at 30 ℃ and cultivation for 96 h. Under the optimiazed conditions of the process，the fermented product had the highest crude protein content and pleasant flavor.
Key words：pineapple pomace;bacterial protein feed;strains selection;fermentation paraments optimization
0 引言
菠萝（Ananas comosus），又名凤梨，含有丰富的糖分、多种维生素和矿物质，广泛分布于我国的广东、广西、云南等地。广东西部的湛江是我国菠萝的集中种植区，且产量大、品质好。目前，菠萝加工的主要产品有罐头、果酱和果汁等，菠萝在加工的过程中会产生高达50%～60%的菠萝皮渣。目前菠萝皮渣仅有一小部分被直接利用作为饲料，绝大部分作为废物丢弃，既浪费资源又对环境造成污染[1]。菠萝皮渣含有丰富的营养成分，经过微生物发酵后可以提高其蛋白含量作为动物饲料[2]。王玲等人[3]用菠萝皮渣酿制果醋。Contreras A等人[4]在奶山羊的饲料中添加菠萝皮渣提取的菠萝蛋白酶，改善了乳品质。梁耀开等人[5]发现，菠萝皮渣混合菌种发酵可生产出高蛋白的畜禽饲料。叶盛权等人[6]成功开发出菠萝皮渣饲料添加剂。
研究旨在对利用菠萝皮渣生产出高菌体蛋白饲料进行菌种筛选[7-9]和对其生产工艺进行优化[10-15]。分别以热带假丝酵母、产朊假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉为出发菌株对菠萝皮渣生产优质高菌体蛋白饲料进行发酵筛选优良菌种;以菠萝皮渣为主要原料、豆粕和麸皮为辅料制备培养基，分别接入各出发菌株的扩大培养液，以发酵产物中的粗蛋白含量为考查指标，先进行单一菌种的筛选，再将得到的较优菌株进行混合使用，设计一定比例的接种量、料液比、发酵时间、发酵温度4个因素对发酵工艺进行优化，以发酵产物的理化品质及感官指标来考查[16-18]，得到最优的发酵工艺条件，为利用菠萝皮渣高效生产养殖业的高菌体蛋白饲料提供试验依据。
1 材料與方法
1.1 试验材料
1.1.1 原料与试剂
新鲜菠萝皮渣，湛江鹰峰食品有限公司提供，于85 ℃下烘干后粉碎备用，按以下配方做成固体发酵培养基：菠萝皮渣（干粉）70 %，麸皮22%，硫酸铵[（NH4）2SO4]3%，尿素[CO（NH2）2] 3%，KH2PO4 2%，料液比为1∶1（V/V）。
1.1.2 菌种
产朊假丝酵母、绿色木霉，广东省微生物研究所菌种保藏中心提供。
热带假丝酵母、黑曲霉，广东海洋大学食品科技学院微生物实验室保存。
1.1.3 仪器与设备
高温灭菌锅、恒温培养箱、生化培养箱、鼓风干燥机、无菌操作台、半微式凯氏定氮仪等。
1.2 分析检验方法
1.2.1 水分含量的测定
采用国标GB 5009.3—2016常压干燥法测定。
1.2.2 粗蛋白含量测定方法
采用国标GB/T 6432—2018凯氏定氮方法测定。
1.2.3 干物质得率及粗蛋白得率测定方法
在115 ℃电热恒温鼓风干燥箱中将发酵产物烘干后进行称质量，通过计算依次得干物质得率、测蛋白得率。
粗蛋白得率 = 干物质得率 × 粗蛋白含量.
1.3 试验方法
1.3.1 菌种活化
（1）产朊假丝酵母活化。首次活化用0.1～0.2 mL的无菌水溶解冻干管中的冻干粉，接种到2支麦芽汁琼脂斜面培养基上，于26 ℃恒温培养箱中培养48 h;然后将首次活化菌种在麦芽汁琼脂斜面培养基上转接活化2次，于4 ℃冰箱中保存备用。
（2）绿色木霉活化。首次活化用0.1～0.2 mL的无菌水溶解冻干管中冻干粉，接种到2支马铃薯斜面培养基上，于26 ℃恒温培养箱中培养7 d;然后将首次活化菌种在马铃薯琼脂斜面培养基上转接活化2次，于4 ℃冰箱中保存备用。
（3）热带假丝酵母活化。挑取2～3环实验室 4 ℃冰箱保存的热带假丝酵母接种到2支麦芽汁琼脂斜面培养基上进行活化，于26 ℃恒温培养箱中培养48 h，于4 ℃冰箱中保存备用。
（4）黑曲霉活化。挑取2～3环实验室保存的黑曲霉接种到2支马铃薯斜面培养基上，于26 ℃恒温培养箱中培养5 d，于4 ℃冰箱中保存备用。
1.3.2 菌种液体种子制备
（1）产朊假丝酵母菌种液。挑取2环新鲜活化的产朊假丝酵母到50 mL麦芽汁液体培养基中，在28 ℃条件下以转速140 r/min振荡培养箱中培养18 h。
（2）热带假丝酵母菌种液。挑取2环新鲜活化的热带假丝酵母到50 mL麦芽汁液体培养基中，在28 ℃条件下以转速140 r/min振荡培养箱中培养18 h。
（3）绿色木霉菌种液。挑取2环新鲜活化的绿色木霉到50 mL马铃薯液体培养基中，在28 ℃条件下以转速140 r/min振荡培养箱中培养24 h。
（4）黑曲霉菌种液。挑取2环新鲜活化的黑曲霉到50 mL马铃薯液体培养基中，在28 ℃条件下以转速140 r/min振荡培养箱中培养24 h。
1.3.3 固体发酵试验
将培养好的液体菌种按设计好的接种量接种 到固体发酵培养基中，在一定的环境条件下进行发酵。
1.4 单一菌种筛选
按照固体培养基质量的10%分别接入产朊假丝酵母、绿色木霉、热带假丝酵母、黑曲霉的液体菌种液到固体培养基中，制成固体发酵培养物，每个试验样品设置3个平行组，另外设置一个空白对照组。在28 ℃恒温箱中培养，2种酵母菌培养物培养3 d，其余2种霉菌培养物培养4.5 d。培养结束后，在115 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干发酵产物，测定发酵固体培养物的干物质得率、粗蛋白含量，计算粗蛋白得率后通过比较筛选得出蛋白质产量最高的各菌种。
1.5 混合菌种对菠萝皮渣生产饲料蛋白发酵工艺优化
将筛选出的最优单一菌种的菌种液按1∶1体积比混合，接种到固体发酵培养物中。设计以不同的接种量、发酵温度、料液比、发酵时间4个单因素分别对发酵工艺进行优化。
1.5.1 接种量条件优化
设置5个接种量梯度6%，8%，10%，12%，14%，其他条件菌保持一致：料液比为1∶1，温度为28 ℃，发酵时间为72 h。每个处理设置3个平行组，设置一个空白对照组。以所测粗蛋白含量最高对应的参数为主，以感官指标最好对应的参数为辅，选择最佳的接种量。
1.5.2 料液比条件优化
设置5个料液比梯度2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，其他条件保持一致：接种量为上述选出的最优参数，温度为28 ℃，发酵时间为72 h。每个处理设置3个平行组。以所测粗蛋白含量最高对应的参数为主，以感官指标最好对应的参数为辅，选择最佳的料液比。
1.5.3 发酵温度条件优化
设置5个温度梯度26，28，30，32，34 ℃，其他条件保持一致：接种量及料液比为上述选出的最优参数，发酵时间为72 h。每个处理设置3个平行组。以所测粗蛋白含量最高对应的参数为主，以感官指标最好对应的参数为辅，选择最佳的发酵温度。
1.5.4 发酵时间条件优化
设置5个温度时间72，84，96，108，120 h其他条件保持一致：接种量、料液比、发酵温度为上述选出的最优参数。每个处理设置3个平行组。以所测粗蛋白含量最高对应的参数为主，以感官指标最好对应的参数为辅，选择最佳的发酵时间。
2 结果与分析
2.1 单一菌种筛选结果
采用产朊假丝酵母、绿色木霉、热带假丝酵母、黑曲霉这4种菌进行单一菌种筛选试验，测定4种单一菌种对应的发酵产物的粗蛋白含量、干物质得率、粗蛋白得率。
单一菌种发酵产物的各指标含量变化情况见 表1。
由表1可知，以产朊假丝酵母、绿色木霉、热带假丝酵母、黑曲霉4种单一菌种及空白对照组进行固体发酵，每组设置3个平行组，表1中粗蛋白含量、干物质得率、粗蛋白得率为3个平行组的平均值。2种酵母菌（产朊假丝酵母、热带假丝酵母）发酵产物各指标情况对比结果表明，粗蛋白含量为产朊假丝酵母高于热带假丝酵母，干物质得率为产朊假丝酵母低于热带假丝酵母，粗蛋白得率为产朊假丝酵母高于热带假丝酵母，因此生产优质蛋白能力更强的酵母菌为产朊假丝酵母。2种霉菌（绿色木霉、黑曲霉）发酵产物各指标情况对比结果表明，粗蛋白含量为绿色木霉高于黑曲霉，干物质得率为绿色木霉低于黑曲霉，粗蛋白得率为绿色木霉高于黑曲霉，因此生产优质蛋白能力更强的霉菌为绿色木霉。综合4种菌及对照组的各指标情况可见，粗蛋白含量最高的2种菌依次为绿色木霉、产朊假丝酵母，粗蛋白得率最高依次为绿色木霉、产朊假丝酵母。由测定结果可知，单一菌种发酵效果越好，物料中粗纤维、糖类物质等被菌种利用转换合成蛋白质的程度越高。因为产物的粗蛋白含量越高，干物质得率越低，最终的粗蛋白得率就越高。
根据上述综合分析，绿色木霉为试验的最优菌种，产朊假丝酵母次于绿色木霉，最终确定绿色木霉和产朊假丝酵母为试验4种单一菌种中的最优菌种。
2.2 混合菌种对菠萝皮渣生产饲料蛋白发酵工艺优化
2.2.1 接种量条件优化结果
按表1结果选出2种菌种的最优菌种分别为绿色木霉及产朊假丝酵母，将绿色木霉及产朊假丝酵母的菌种液按1∶1体积比混合备用。在料液比为1∶1，发酵温度为28 ℃，发酵时间为72 h，绿色木霉和产朊假丝酵母按1∶1体积比，混合菌种液接种量分别为6%，8%，10%，12%，14%的条件下进行菠萝皮渣的固态发酵。
接种量条件优化结果见图1。
随着发酵时间的推移，菠萝皮渣固态发酵培养基发酵后蛋白质含量的高低与菌体接种量、固态发酵培养基的水分、温度、发酵时间有着紧密联系。在固态发酵培养基含水量、温度和发酵时间一定的情况下，增大菌种接种量有利于提高菌体生长量，从而提高产品蛋白质的含量。
由图1可知，菌种接种量在6%时菠萝皮渣发酵产物中蛋白质含量很少，在接种量为10%之前蛋白质含量随着菌种接种量的增加逐渐增加，当菌种接种量达到10%左右时，菠萝皮渣固态发酵培养基中的蛋白质含量达到了最高水平，继续增加接种量，蛋白质含量稍有下降但也趋于平稳，高于10%菌种接种量的发酵产物中蛋白质含量没有明显增加，可能与菌种发酵过程中从菠萝皮渣固态发酵培养基中获取的营养成分有限有关。从试验结果及生产成本角度来看，在料液比1∶1，发酵温度28 ℃，发酵时间72 h的条件下，产朊假丝酵母和绿色木霉按1∶1体积比混合菌种液，接种量10%为最佳的发酵条件。
2.2.2 料液比条件优化结果
在绿色木霉和产朊假丝酵母1∶1体积比混合菌种液，接种量为10%，发酵温度为28 ℃，发酵时间为72 h，料液比分别以2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的條件下进行菠萝皮渣固态发酵。
料液比条件优化结果见图2。
由图2可知，菠萝皮渣固态发酵培养基中水分含量对产物中蛋白质含量有很大影响，水是微生物生长必需的生长条件。在料液比为1∶3之前，蛋白质含量随着水分含量的增加而增加，料液比在1∶3左右蛋白质含量达到最高水平，料液比1∶3后可能由于水分含量增加对微生物的生长繁殖起抑制作用，从而使发酵产物蛋白质含量下降。由此可见，在工艺生产过程中，从生产操作、节约成本角度出发，确定最佳的发酵料液比为1∶3。
2.2.3 发酵温度条件优化结果
在绿色木霉和产朊假丝酵母1∶1体积比混合菌种液，接种量为10%，料液比为1∶3，发酵时间为72 h，发酵温度分别为26，28，30，32，34 ℃的条件下进行菠萝皮渣固态发酵。
发酵温度条件优化结果见图3。
由图3可知，发酵温度对微生物的生长影响很大，26 ℃时发酵产物蛋白质含量较低，微生物生长缓慢，固态发酵培养基中营养成分的利用率不高，随着温度的上升，产品蛋白质含量呈上升趋势，当发酵温度达到30 ℃时产品蛋白质含量达到最高，继续提高培养温度发酵产物则蛋白含量降低，菌种的发酵效果降低，这与菌种的生长受到温度抑制有关，温度过高可导致微生物的死亡。由此可见，发酵温度控制在30 ℃左右时发酵效果最佳。
2.2.4 发酵时间条件优化结果
在绿色木霉和产朊假丝酵母1∶1体积比混合菌种液，接种量为10%，料液比为1∶3，发酵温度为 30 ℃，发酵时间分别为72，84，96，108，120 h的条件下进行菠萝皮渣固态发酵。
发酵时间条件优化结果见图4。
由图4可知，随着发酵时间的增加，产品蛋白质含量增加，当发酵时间达到96 h时达到最大值，继续增加发酵时间，蛋白质含量略微下降且逐渐趋于平稳，导致蛋白质含量下降的原因可能是菠萝皮渣固态发酵培养基中可提供微生物生长需要的碳源及氮源消耗完了，使最终发酵产物中的蛋白质含量偏低，也可能是由于霉菌发酵时间延长后形成了大量孢子，造成了负面的影响，从而使蛋白质含量的测定结果偏低。由此可见，发酵时间在96 h左右的发酵效果最佳。
2.3 品质检测
经过最佳发酵条件（绿色木霉和产朊假丝酵母1∶1体积比混合菌种液，接种量为10%，料液比为1∶3，发酵温度为30 ℃，发酵时间为96 h）的发酵，将固态发酵培养基中的产品进行提取，通过物理和感官2个方面的测定，检验其品质。
发酵条件优化前后发酵产物粗蛋白含量对比见图5。
发酵条件优化后，测定优化后发酵产物的粗蛋白含量——利用半微式凯氏定氮法测定其粗蛋白的含量为20.27%。由图5可知，蛋白质含量从发酵条件优化前（没有外加菌种，料液比为1∶1，发酵温度为28 ℃，发酵时间为72 h）的4.05%提升到发酵条件优化后的20.27%。
产朊假丝酵母单一菌种的发酵产物有酸味，气味不太宜人;产朊假丝酵母单一菌种的发酵产物有类似啤酒的酒精清香，气味宜人。绿色木霉和产朊假丝酵母种子液1∶1体积比混合发酵的产物气味宜人，有菠萝的芳香。
3 结论
（1）试验通过对热带假丝酵母、产朊假丝酵母、绿色木霉、黑曲霉4种菌种进行单一菌种筛选，测定其粗蛋白含量、干物质得率、粗蛋白得率并进行综合分析，发现绿色木霉和产朊假丝酵母为试验4种单一菌种中的2株最优菌种。
（2）在单一菌种筛选试验的基础上，继而进行混合菌种对菠萝皮渣生产饲料蛋白发酵工艺优化的试验，发现绿色木霉和产朊假丝酵母1∶1体积比混合发酵菠萝皮渣生产菌体蛋白饲料的最佳工艺条件为接种量10%，料液比1∶3，发酵温度30 ℃，发酵时间96 h。
（3）经过蛋白质含量测定及感官品质测定，发现发酵条件优化后产物的营养和感官都有极大提高，发酵条件优化后菠萝皮渣发酵的蛋白质含量从4.05%提高到20.27%，可成为畜禽优质高菌体蛋白饲料。
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收稿日期：2019-10-19
基金项目：广东海洋大学 2018 年地方高校国家级大学生创新训练项目（CXXL2018009）。
作者简介：陈间美（1997— ），女，本科，研究方向为食品质量与安全。
通讯作者：王 玲 （1965— ），女，硕士，副教授，研究方向为食品加工技术及食品微生物学方面的教学与研究。