周新新，朱鹤云，范琢玉,2，李乐乐，林晓影，冯 波，崔 悦*，关 皎*
(1. 吉林医药学院 药学院，吉林吉林 132013；
2. 延边大学药学院，吉林延吉 133002)
枳实为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种或甜橙(CitrussinensisOsbeck)的干燥幼果，为药食同源中药，主要分布在四川、湖南等地[1-2]。文献报道，枳实具有多种药理作用，包括促进胃肠蠕动[3-5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等。其作为脾胃药，被兽医用于治疗动物便秘、胃积食、胃阻塞等[8-10]，主要活性成分为黄酮类，如柚皮苷、新橙皮苷等[1]。药材的提取有多种方法，其中超声法较经典且应用广泛[11]。闪式提取法则是一种新兴的提取方法，具有省时、高效等优点[12-15]。目前，尚未见超声法和闪式提取法提取枳实总黄酮的对比研究。本文以柚皮苷和新橙皮苷总提取率作为枳实总黄酮提取率[总黄酮的提取率(%)=提取液中总黄酮的含量/药材质量×100%]为评价指标，通过正交试验分别优选出两种方法的最佳工艺并比较，最终确定枳实总黄酮的最佳提取工艺，为枳实在兽药新药开发领域和饲料工业化生产方面提供一定依据。
1.1 仪器 超高快速液相色谱仪(Prominence UFLC)：日本岛津公司；
微型万能粉碎机(FW80)：天津市泰斯特仪器有限公司；
闪式提取器(JHBE-50S)：河南金鼐科技发展有限公司；
超声波清洗器(KQ-500GVDV)：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 材料 枳实药材购自吉林市吉林大药房；
柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品购自成都普菲德生物技术有限公司(纯度>98%，批号：110730-201614，110729-201714)；
无水乙醇为分析纯，购自永大化学试剂有限公司；
甲醇为色谱级，购自美国Fisher公司。
2.1 枳实总黄酮含量测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱采用Shim-pack XR-ODS柱(3.0×75 mm，2.2 (m，SHIMADZU)，流动相采用0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序如下：0-10 min，20-30%，检测波长为265 nm，流速为0.4 mL/min，柱温为30 ℃，进样体积为5 μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 分别取柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，以甲醇为溶剂制得两种成分的对照品储备液分别为280 μg/mL和560 μg/mL。
2.1.3 供试品溶液的制备
2.1.3.1 超声法 称取枳实药材粉末0.5 g于50 mL具塞锥形瓶中，加入50%乙醇35 mL，提取功率200 W，时间75 min。所得滤液经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.3.2 闪氏提取法 称取枳实药材粉末0.5 g于容器中，加入50%乙醇35 mL，提取时间3 min，其余操作同“2.1.3.1”，即得。
2.1.4 标准曲线的制备 分别取柚皮苷和橙皮苷对照品储备液适量，以用甲醇为溶剂配制两种成分的系列混合对照品溶液。柚皮苷浓度为3.5、7、17.5、35、70、140 μg/mL，新橙皮苷浓度为7、14、35、70、140、280 μg/mL
2.1.5 方法学考察
2.1.5.1 标准曲线的建立 以待测物峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)建立线性回归方程。
2.1.5.2 精密度试验 取混合对照品溶液(柚皮苷35 μg/mL，新橙皮苷70 μg/mL)适量，按上述色谱条件连续注入色谱仪中(n=6)，计算两种成分峰面积的RSD。
2.1.5.3 稳定性试验 取同一批枳实药材粉末制备供试品溶液。置于室温条件下，分别于0、2、8、12、24 h取样品分析，计算两种成分峰面积的RSD。
2.1.5.4 重复性试验 取同一批枳实药材粉末6份分别制备供试品溶液。进样分析并计算两种成分峰面积的RSD。
2.2 提取工艺
2.2.1 超声法 称取枳实药材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳实质量/溶剂体积)1∶70加入50%乙醇，提取功率设为200 W，提取75 min。
2.2.2 闪式提取法 称取枳实药材粉末于提取容器中，按料液比(g/mL，枳实质量/溶剂体积)1∶70加入50%乙醇，提取3 min。
2.3 工艺比较 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定并比较两种方法枳实总黄酮的提取率，确定最佳提取工艺。
3.1 色谱条件的建立 混合对照品溶液、枳实样品溶液色谱图如图1所示。
1. 柚皮苷；
2. 新橙皮苷1. naringin; 2. neohesperidin图1 混合对照品溶液(A)和枳实样品溶液(B)色谱图Fig 1 Chromatograms of mixed reference solution (A) and Aurantii Fructus Immaturus sample solution (B)
3.2 方法学考察
3.2.1 标准曲线的建立 柚皮苷为Y=1.290×104X+1.659×104(r=0.9998)，新橙皮苷为Y=9.098×103X+2.397×103(r=0.9999)。两种成分的线性范围分别为3.5～140 μg/mL，7～280 μg/mL。
3.2.2 精密度试验 两种成分峰面积的RSD分别为1.1%和1.0%，表明仪器具有良好的精密度。
3.2.3 稳定性试验 两种成分峰面积的RSD分别为0.8%和0.7%，结果表明枳实样品在24 h内稳定性良好。
3.2.4 重复性试验 两种成分峰面积的RSD分别为0.9%和1.1%，表明本方法具有良好的重复性。
3.3 提取工艺
3.3.1 超声法的正交试验设计 分别以乙醇浓度(A)、时间(B)、功率(C)和料液比(D)作为考察因素，按表1设计试验。超声法正交试验结果和方差分析结果如表2和表3所示，各因素对提取工艺的影响顺序为 A(乙醇浓度)>C(功率)>D(液料比)>B(时间)且各因素对提取工艺均无显著性差异，最佳工艺为 A1B3C2D3，即用50%乙醇，按料液比1∶70以200 W功率提取75 min。
表1 超声法正交试验因素水平表Tab 1 Factors level table of orthogonal test of ultrasonic method
表2 超声法正交试验结果Tab 2 Orthogonal test results of ultrasonic method
表3 超声法方差分析结果Tab 3 Analysis results of ultrasonic method square difference
3.3.2 闪式提取法的正交试验设计 分别以乙醇浓度(A)、料液比(B)和时间(C)作为考察因素，按表4设计试验。闪式提取法正交试验结果和方差分析结果如表5和表6所示，各因素对提取工艺的影响顺序为 A(乙醇浓度)>B(液料比)>C(时间)且各因素对提取工艺均无显著性差异，最佳工艺为 A1B3C3，即用50%乙醇，按料液比1∶70提取3 min。
表4 闪式提取法法正交试验因素水平表Tab 4 Factors level table of orthogonal test of flash extraction method
表5 闪式提取法正交试验结果Tab 5 Orthogonal test results of flash extraction method
表6 闪式提取法方差分析结果Tab 6 Square difference analysis results of flash extraction method
3.4 工艺比较 如表7所示，两种方法枳实总黄酮的最佳提取工艺均为50%乙醇和1∶70的料液比，超声法提取率(25.26%)高于闪式提取法(18.65%)，但超声法所用时间(75 min)为闪式提取法(3 min)的25倍。
表7 不同提取方法枳实总黄酮的提取率Tab 7 The extraction rates of total flavonoids from AurantiiFructus Immaturus by different extraction technologies
枳实中含有丰富的黄酮类化合物，其中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高且较稳定[16]，因此，本实验以柚皮苷和新橙皮苷提取率之和作为枳实总黄酮提取工艺评价指标。文献报道，柚皮苷作为饲料添加剂可以调节和控制脂肪代谢、提高肉质、提高动物机体免疫力[17-18]；
新橙皮苷能够促进胃肠道蠕动[19]。枳实是一种应用价值很高的中兽药，合理的提取工艺对于枳实在畜牧和动物医学领域的开发和利用具有重要意义。随着提取工艺的不断进步，未来枳实总黄酮的提取将更加快速、高效。
单因素试验中分别考察了乙醇浓度、提取时间、液料比和提取功率等因素；
采用正交设计试验分别优化并比较了超声法和闪式提取法枳实总黄酮的最佳提取工艺。两种方法最佳工艺乙醇浓度、料液比均相同。超声法的提取率为25.26%，闪式提取法的提取率为18.65%，但超声法所用时长为闪式提取法的25倍。综合考虑枳实总黄酮的工业化生产对时间和经济成本的要求，闪式提取法更加省时、简单和快速，适于大规模的兽药工业化生产。最终确定闪式提取法为枳实总黄酮的最佳提取方法，其提取工艺为：50%乙醇，料液比1∶70，提取3 min。